La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real es la capacidad de controlar el progreso de la PCR conforme se produce (es decir, en tiempo real). Los datos se recopilan por lo tanto durante el proceso de la PCR, en lugar de al finalizar esta. Esto revoluciona completamente el método de cuantificación basada en PCR de ADN y ARN. En la PCR en tiempo real (qPCR), las reacciones se caracterizan por el punto en el tiempo durante el ciclado en el que se detecta por primera vez la amplificación de un objetivo en lugar de la cantidad de objetivo acumulado tras un número fijo de ciclos. Cuanto mayor sea el número de copias de inicio del ácido nucleico objetivo, antes se observará un aumento significativo de la fluorescencia.

La qPCR incluye ciclos de calentamiento y enfriamiento para generar copias del ADN objetivo. Las copias generadas se detectan mediante el uso de sondas fluorescentes permitiendo así estimar la cantidad de ácido nucleico en la muestra.

Se requieren cebadores específicos para la región de interés, una sonda fluorescente, una enzima polimerasa y nucleótidos para construir nuevas cadenas de ADN. En caso de amplificar ARN, es necesario emplear la enzima retro transcriptasa que convierte el ARN en ADN.

Los cebadores son pequeñas secuencias de ADN diseñadas para hibridar con regiones específicas del ADN que se quieren amplificar. Las sondas son moléculas marcadas con fluoróforos que se utilizan para detectar la amplificación en tiempo real.

Los cebadores (Forward y Reverse) y sondas se diseñan para complementar secuencias específicas del ADN a amplificar. Ambos cebadores deben tener una temperatura de fusión (Tm) similar y no generar estructuras secundarias.

Los kits de PCR VIASURE utilizan sondas TaqMan. Las sondas Taqman son sondas de hidrólisis que están formadas por un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5’ y un desactivador de la fluorescencia o quencher unido en el extremo 3’. Se basan en la actividad exonucleasa 5’-3’ de la Taq polimerasa. A medida que la Taq sintetiza la nueva cadena de ADN en sentido 5’-3’ degrada la sonda ya hibridada, provocando la liberación del fluoróforo de la sonda, su separación del quencher y la consecuente emisión de fluorescencia.

La Tm es crucial ya que afecta la especificidad de la unión entre cebadores y ADN. Una Tm adecuada asegura una hibridación específica durante la amplificación.

La qPCR incluye controles negativos (sin ADN), controles positivos y controles internos para verificar la calidad de la reacción. En sustitución al control interno, se puede emplear control de extracción.

Los controles negativos garantizan que no haya contaminación y los controles positivos validan el funcionamiento de la reacción.

Es fundamental emplear controles ya que permiten asegurar la validez de los resultados obtenidos. Los kits VIASURE de PCR incluyen controles negativos y positivos que se añaden como una muestra adicional para garantizar que no hay contaminación y validar el funcionamiento de todos los reactivos de la reacción. Además, cada test incluye un control interno (CI), esto es una reacción paralela realizada en el mismo pocillo de reacción. Se utiliza para verificar el ensayo en cada una de las muestras analizadas, como por ejemplo que no haya inhibidores de la PCR en el eluido. Este CI puede ser sustituido por un control de extracción (CE).

En los resultados de la PCR a tiempo real se observan las curvas de amplificación dadas por el crecimiento exponencial del nivel de fluorescencia, que es proporcional al número de copias de un gen obtenidos en una amplificación ubicadas en el eje de las ordenadas frente al número de ciclos de la reacción que hace falta llevar a cabo (Ct), ubicado en el eje de las abscisas.

El valor Ct o Valor de ciclo de umbral, es el ciclo en el cual la curva en su fase exponencial corta de forma perpendicular con el threshold o valor umbral, para cada reacción y por tanto se considera que existe amplificación. El Ct es un valor semicuantitativo inversamente relacionado con la cantidad de Ácido nucleico en la muestra, de manera que un número bajo de Ct está relacionado con mayor carga del patógeno y viceversa.

Ct (umbral de ciclo): número de ciclo fraccional en el que la fluorescencia supera el NTC (control sin plantilla) del umbral fijo: una muestra que no contiene una plantilla. Se utiliza para comprobar la calidad de la amplificación.

El threshold o valor umbral, es la linea imaginaria a partir de la cual una curva de qPCR empieza a reflejar una curva exponencial. Esta forma exponencial refleja que la eficiencia de la reacción es constaste durante unos ciclos determinados.

Por tanto, nos ayuda a  discernir entre un resultado negativo y un resultado positivo. Todas las curvas que se encuentren por encima de esta línea serán positivas, las que queden por debajo serán negativas.

Siempre dependerá de nuestro termociclador, pero es recomendable fijarse en el valor dado por el software de forma automática.

Respuesta: La fluorescencia basal es aquella que está presente en los primeros ciclos de la reacción. Esta fluorescencia no es causada por una reacción de amplificación persé sino que es ocasionada por la propia química de los reactivos.

Se debe eliminar para que la fluorescencia obtenida por todas las muestras en los primeros ciclos sea cero y se puedan analizar correctamente las curvas. De esta manera se fija a partir de que valor la fluorescencia obtenida para cada canal es suficientemente alta como para que se consideres que es una amplificación “real”.

Normalmente, todos los softwares usados para el análisis de resultados fijan automáticamente la Baseline para cada curva de manera individual. Sin embargo, este parámetro también se puede fijar de manera manual en aquellas curvas donde el análisis automático no ha sido satisfactorio. Se recomienda fijarlo entre los primeros ciclos de la curva, desde el ciclo 3 al 15, para eliminar la fluorescencia basal presente en los primeros ciclos de la reacción.

El Background es la fluorescencia inespecífica de la reacción producida por la química de los reactivos. Los equipos de PCR suelen eliminar esta señal automáticamente para mostrar unos resultados claros.

La referencia pasiva es un colorante que proporciona una referencia interna según la cual se puede normalizar la señal de los fluoróforos del kit durante el análisis de datos. La normalización es necesaria para corregir las fluctuaciones previstas causadas por los cambios en la concentración o el volumen. Viasure no usa ninguna referencia pasiva.

Los resultados de qPCR se cuantifican calculando una curva patrón o estándar que relaciona la cantidad de ADN y el valor Ct empleando muestras de concentración conocida.

La eficiencia se calcula a partir de las pendientes de las curvas de amplificación y se usa para determinar cuántas copias de ADN se duplican en cada ciclo.

La calidad y cantidad del ADN/ARN influyen en los resultados. Se deben seguir protocolos adecuados de extracción para asegurar material de partida de alta calidad.

La qPCR es altamente sensible, rápida y cuantitativa. Además, su capacidad para detectar cambios sutiles en la expresión génica la hace esencial en la investigación biológica.

Una qPCR multiplex es aquella en la que se amplifican varias secuencias de ADN simultáneamente pudiendo detectar y diferenciar varias dianas a la vez. Para ello se utilizan múltiples cebadores y sondas marcadas con diferentes fluoróforos para que puedan emitir su fluorescencia en los diferentes canales de lectura. En el caso de los kits de VIASURE los canales utilizados son FAM, HEX, ROX y Cy5.